一种高度灵敏的CD63抗体功能化硅纳米线Bio-FET

外泌体因其与亲代细胞的高度同源性而在临床诊断中发挥着非常重要的作用。然而，传统的外泌体检测方法仍面临设备昂贵、灵敏度低、程序复杂等挑战。场效应晶体管（FET）不仅是现代微电子工业中最重要的电子元件，而且由于其具有快速响应、高灵敏度和无标记检测等优点，在生物分子检测方面显示出巨大潜力。

据麦姆斯咨询报道，中国科学院微电子研究所（Institute of Microelectronics，Chinese Academy of Sciences）的研究人员开发了一种用特定抗体进行化学修饰的硅（Si）纳米线场效应晶体管（Si-NW Bio-FET）器件，用于外泌体的电学和无标记检测。相关研究以“Si nanowire Bio-FET for electrical and label-free detection of cancer cell-derived exosomes”为题发表在Microsystems & Nanoengineering期刊上。

首先，研究人员对硅纳米线Bio-FET进行了制造和表征，如图1a和图2所示，该器件由硅纳米线FET器件和PDMS微流体层构成，尺寸为15mm × 26mm，具有用于通过外部注射泵加载外泌体样品的入口和出口（图2a）。通过SEM成像技术可观察到均匀的硅纳米线（Si-NW，图2b），其长10μm、宽45nm、高29nm，具有矩形横截面。外泌体特异性抗体共价固定在硅纳米线的表面，作为外泌体灵敏检测的识别元件（图1b）。此外，抗体与外泌体之间的亲和相互作用可能会引起硅纳米线Bio-FET器件的电响应（即漏极电流变化和阈值电压变化），从而实现外泌体的电学和无标记检测（图1c）。

图1 a）硅纳米线Bio-FET示意图；b）硅纳米线Bio-FET横截面示意图；c）信号变化示意图；d）硅纳米线Bio-FET的简化制造工艺示意图：（I）具有p型（100）晶面的SOI晶圆；（II）顶部硅层的减薄；（III）SiO2/α-Si/Si3N4层的沉积；（IV）α-Si的图案；（V）Si3N4的沉积；（VI）Si3N4硬掩模的形成；（VII）去除α-Si；（VIII）SiO2和顶部硅反应离子刻蚀（RIE）；（IX）硅纳米线的形成。

图2 a）硅纳米线Bio-FET图像；b）硅纳米线区域的SEM图像（比例尺为5?m）：插图I为硅纳米线横截面；插图II为硅纳米线俯视图。

接着，研究人员使用硅纳米线Bio-FET对外泌体进行电学和无标记检测。CD63蛋白作为跨膜-4超家族（transmembrane-4 superfamily）的成员之一，已被发现在大多数外泌体亚群中含量丰富。此外，CD63蛋白在A549外泌体表面高度表达，因此，研究人员选择CD63抗体作为捕获抗体。

为了研究Bio-FET对外泌体的反应，利用A549细胞培养物的上清液（其中存在来自A549细胞系的外泌体颗粒）作为分析物，并在经过CD63抗体修饰后，使用Bio-FET检测A549细胞培养上清液中的外泌体。

图3a显示了分别用PBS以及10倍和100倍稀释的A549细胞培养上清液测量的Bio-FET的漏极电流-栅极电压（ID-VG）转移曲线。ID-VG曲线显示，A549上清液稀释液中的ID值低于空白PBS溶液。此外，ID随着稀释因子的降低（溶液中外泌体浓度的增加）而降低。PBS、100倍稀释的A549上清液和10倍稀释的A549上清液的阈值电压（Vth，对应ID为2.19?nA的栅极电压）分别为-1.35?V、-2.16?V和-3.03?V。随着外泌体浓度的增加，Vth向左移动。因此，实验结果表明，Bio-FET可成功测量A549细胞培养上清液中的外泌体浓度，且ID-VG曲线的变化与外泌体浓度有关。

图3 a）用PBS和不同稀释度的A549细胞培养上清液测量的硅纳米线Bio-FET的ID-VG曲线；b）由CD63抗体修饰的硅纳米线捕获的外泌体的SEM图像（比例尺：400nm）；c）DiO染色后CD63抗体修饰的硅纳米线Bio-FET的荧光图像；d）无CD63抗体修饰的硅纳米线的SEM图像（比例尺：400nm）；e）DiO染色后未经抗体修饰的硅纳米线Bio-FET的荧光图像（比例尺：500μm）。

为了验证外泌体是否可以被捕获在硅纳米线Bio-FET表面，研究人员使用SEM进行观察。图3b的SEM图像中的红色虚线圆圈内区域清楚地显示了外泌体在硅纳米线上被捕获。相比之下，没有CD63抗体修饰的硅纳米线上几乎没有外泌体颗粒（图3d），从而证明了外泌体被CD63抗体成功捕获在硅纳米线上。为了进一步验证硅纳米线上外泌体的存在，研究人员将CD63抗体捕获的外泌体用DiO染料染色，该染料可以染色外泌体的脂质双层膜。通道内的荧光图像如图3c、3e所示。与未经抗体修饰的硅纳米线Bio-FET相比，CD63抗体修饰的硅纳米线Bio-FET内部显示出荧光强度显著增加，进一步证明了外泌体被抗体成功捕获。

为了进一步测试硅纳米线Bio-FET对外泌体检测的敏感性，研究人员通过超速离心（UC）纯化了A549衍生的外泌体样品。首先将外泌体浓度由1.84?×?10?个颗粒/mL稀释至1.84?×?10?颗粒/mL~1.84?×?10?颗粒/mL区间的不同浓度，并将这些样品应用于CD63抗体修饰的硅纳米线Bio-FET，随后记录硅纳米线Bio-FET的ID-VG曲线。如图4a所示，漏极电流随着检测过程中外泌体浓度的增加而降低。此外，随着外泌体浓度的增加，Vth向左移动，且未结合的抗体位点逐渐被填充，导致电流逐渐减小。图4b显示了外泌体浓度和电压阈值之间的线性关系，获得的校准曲线显示在4-log动态范围内可以进行定量检测，在3σ处的检测限（LOD）为2159个颗粒/mL（约等于2个颗粒/μL），高于一些基于电化学和其他方法的检测。通过设计微通道结构以增强分析物溶液与通道底部纳米线之间的相互作用，可以进一步提高检测灵敏度。

图4 a）硅纳米线Bio-FET与不同浓度外泌体相互作用的转移曲线；b）硅纳米线Bio-FET在一系列外泌体浓度下的Vth。

最后，研究人员研究了硅纳米线Bio-FET的实时检测能力。将样品注入微通道5分钟后测量实时ID。VG和VD分别设置为-5V和-1.2?V。不同外泌体浓度的实时ID如图5a所示。从图中可以看出，随着时间的增加，ID趋于保持不变，随着浓度的增加，ID逐渐减小，而稳态ID和外泌体浓度之间呈对数呈线性关系（图5b）。

对微流控通道内外泌体浓度和漏极电流的关系进行研究，结果如图5c所示，外泌体浓度的增加导致漏极电流降低。此外，对微通道内外泌体浓度降低的实时检测结果表明，当新的外泌体溶液注入通道时，如果抗体结合位点未被占据，外泌体与抗体的结合会继续，从而进一步降低电流。因此，硅纳米线Bio-FET具有实时监测微流体通道中分析物浓度变化的潜力。

图5 a）不同浓度外泌体溶液的实时响应；b）稳态漏极电流与外泌体浓度之间的关系；c）微通道内外泌体浓度变化时漏极电流的实时响应。

总之，该研究开发了一种高度灵敏的CD63抗体功能化硅纳米线Bio-FET，用于外泌体的电学和无标记检测。结果表明，硅纳米线Bio-FET对A549外泌体的检测限为2159个颗粒/mL，高于许多其他电化学方法。此外，硅纳米线Bio-FET能够实时监测外泌体的变化，其实时电流随着外泌体浓度的增加而降低。从而为灵敏、无标记和实时的外泌体检测提供了一种新的CMOS兼容策略，有望在未来用于实时监测和临床诊断。

论文链接：
https://doi.org/10.1038/s41378-022-00387-x

审核编辑 ：李倩