虹科案例 | CELESTA光源应用于3D高内涵成像

01背景

高内涵成像（High-content imaging）是一种基于生物图像技术的高通量细胞成像筛选方法，它将自动多色荧光成像与量化数据分析相结合，以同时评估2D和3D细胞以及其他类型的生物样本培养中单个细胞的多种分子特征。正因为光源技术与显微镜技术在过去几十年所取得的惊人进步，HCI才成为可能。具体来说，显微镜现在能够通过荧光激发与自动化程序获取大量图像，HCI正逐渐被研究人员采用，因为它能够在使用数百、数千甚至数百万种新化合物处理后，对许多细胞的活性进行无偏倚的多参数可视化和量化。

三维细胞培养技术 ( three-dimensionalcell culture, TDCC ) 是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长, 构成三维的细胞-载体复合物。

三维细胞模型系统的高内涵成像能比二维细胞培养更准确地反映体内组织生理学和疾病病理生理学的测试活性：在2D培养中，只有与培养表面接触的一侧发生细胞吸附。许多细胞从组织中分离出来并置于平面细胞培养表面时，会逐步变得更加扁平，分裂异常，并丧失其分化表型。而在3D培养中，整个细胞表面都可以发生细胞吸附。细胞吸附和伸展的程度影响其增殖、凋亡和分化功能。3D培养可以建立起生理上的细胞-细胞与细胞-细胞外基质相互作用，模拟天然组织的特异性，为提高候选药物的临床成功率提供了潜力。

当然，三维标本需要三维成像，因此关键在于达到成像系统主要部件（光源、显微镜和相机）的性能要求。

02挑战

苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系的显微镜工程师Tom Lummen博士对实施3D活细胞成像的要求以及如何使用虹科的CELESTA激光光源满足这些要求提供了一些见解。

“我是运营成像核心设施的显微镜团队的一员。我们提供20台高端自动显微镜，以满足我们部门用户的成像需求。我们一直在寻找这些系统的新功能或扩展功能。我们有非常广泛的成像应用，这些应用范围从活细胞中的小亚细胞特征，必须在短时间内可视化，一直到需要监测数周的非常大的3D类器官或组织培养物的开发。旋转盘共聚焦显微镜的需求越来越大，因为数据采集需求正朝着获取单细胞参数的方向发展，但具有非常好的统计数据和/或时间分辨率。我们的倒置旋转盘系统面向动态样品的活细胞观察，但我们也看到对高3D空间通量的需求增加。”

?????????????????????????????????????????旋转盘共聚焦显微镜允许对活体样品进行快速3D成像，激光束通过角锥棱镜的小孔聚焦，平行地发送向磁盘。针孔周围的微镜反射一个光束回到角锥棱镜里。每一个亚光束向后反射并通过针孔聚焦。荧光激发通过针孔聚焦，通过半反半透镜传送。旋转盘共聚焦显微镜允许对活体样品进行快速3D成像，激光束通过角锥棱镜的小孔聚焦，平行地发送向磁盘。针孔周围的微镜反射一个光束回到角锥棱镜里。每一个亚光束向后反射并通过针孔聚焦。荧光激发通过针孔聚焦，通过半反半透镜传送。

?????????????????????????????????????????但利用这种技术需要在竞争需求之间取得平衡。Lummen博士描述了所涉及的一些障碍，以及它们如何影响他和他的团队，“在显微镜下，在设置系统时总是需要权衡，你不能同时拥有所有优势。我们试图追求的是专用系统，但我们试图使它们尽可能保持可调谐性。我们确定了对专用倒置旋转盘系统的需求，该系统面向高通量观察，无论是空间还是时间。这时，我们开始探索有哪些照明技术。用于高速高通量活细胞成像的合适光源（与旋转盘的速度配对）需要高度灵活，并提供高强度，时间稳定的光输出，并能够在多条光谱线之间快速切换。

03解决办法

虹科的CELESTA激光光源被确定为此类动态活细胞旋转盘应用的理想照明源。Lummen博士与CELESTA分享了他的经验。“CELESTA与CrestOptics X-Light v3旋转盘共聚焦扫描仪，Nikon Ti2显微镜和Teledyne Photometrics Kinetix sCMOS相机相结合，使我们能够在同一时间跨度内成像更多细胞，这可以按比例增加我们可以提供给用户的数据吞吐量（图1）。 图 1. 在固定的Fucci4 HeLa细胞上进行五色成像。图像是使用100X，NA 1.45油浸物镜和25 mm FOVKinetix相机拍摄的强度投影。在配备CrestOpticsX-light v3旋转盘共聚焦扫描仪，虹科CELESTA光引擎和TeledynePhotometrics Kinetix sCMOS相机的尼康Ti2显微镜上记录。Fucci4是基于荧光蛋白mTurquoise，mClover，mKO和mMaroon的细胞周期依赖性表达的细胞周期位置指示剂。图片来源：JavierCasares，D-BSSE，苏黎世联邦理工学院。

CELESTA的高强度输出与Kinetix相机的大视场（FOV）相结合，使我们能够在每个时间点成像更多的细胞，或者每个复合大图像的图块更少。尼康Ti2和CrestOptics X-Light v3旋转盘共聚焦扫描仪的大视场相结合，让我们配置了双摄像头大视场设置（图2）。这使我们能够进一步复制数据吞吐量或在动态样品中执行真正的并发双通道活细胞成像。此外，虹科CELESTA的光谱输出将我们的成像能力扩展到近红外（nIR）。

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04虹科CELESTA光源介绍

虹科CELESTA光源的光谱输出与CELESTA实物图
虹科-CELESTA——面向高端成像的固态激光光源

虹科CELESTA和CELESTA quattro光引擎包括4-7个可单独控制的固态激光光源阵列（在400-800nm范围提供7个可选波长），并且支持快速切换。CELESTA光引擎在1.5mm直径光纤的远端出光，其7个激光器中的每一个都能提供约1000mW的输出功率。同样，CELESTA quattro光引擎以相同的输出功率规格提供了一个具有性价比的4或5线选择。激光输出与复杂的控制和监测系统相结合，为旋转盘共聚焦显微镜、空间分辨率转录组学和其它高级成像应用提供所需的高清晰度性能。

?可广泛应用于：细胞遗传学；药物研发/高内涵筛选；基因表达分析；光遗传学等