一文读懂共聚焦拉曼显微镜

文章来源：老千和他的朋友们

原文作者：孙千

本文介绍了共聚焦拉曼显微镜。

“拉曼光谱是一种弱散射技术，通常不到百万分之一的激发光子会产生一个拉曼光子。这种情况在共聚焦拉曼显微镜中更加困难，因为探测体积被小针孔缩小，必须在短时间内收集成千上万的光谱。因此，精细的设计激发和探测光学器件，以及适当选择光谱仪和探测器对于成功的实验非常重要。”

1引言

拉曼散射通常是一种非常微弱的效应，因为激发的光子与参与散射过程的分子之间存在非谐振的相互作用。因此，在一个给定的测量几何中，拉曼光子的数量是有限的，任何提高光子收集效率的技术进步都是非常重要的。尽管拉曼效应在1928年已经由Chandrasekara-Raman发现（两年后被授予诺贝尔物理学奖），但常规的拉曼光谱实验直到1960年代激光的发展才得以实现。

在20世纪70年代和80年代，电荷耦合器件（CCD）的发展取代了光电倍增管（PMT），实现了多通道探测。WillardS. Boyle和George E. Smith因发明了CCD相机而获得2009年诺贝尔物理学奖。

由于硅探测器在光谱的可见和近红外区域与PMT相比具有更高的量子效率（QE），而且CCD可以作为线性探测器使用，这使得测量时间至少减少了三个数量级。以前，感兴趣的拉曼波段必须在一个PMT上扫描，一个点探测器只对光谱仪出口狭缝所选择的非常窄的波长范围敏感。随着CCD的引入，光谱仪的出口狭缝可以由一个线性CCD探测器重新放置，从而可以同时采集超过1000个通道。

2拉曼显微镜的发展

在90年代，一些公司首次将拉曼光谱仪与光学显微镜结合起来，光学显微镜被用来将激发光聚焦到一个直径为几微米的小点上，以便从更小区域获得拉曼光谱。这是第一次从直径只有几微米的区域中获得拉曼光谱。物高NA的物镜对拉曼信号的高效率收集有好处，另一方面，当人们把光聚焦到一个小区域或点上时，必须注意不要用过于强烈的激光束加热样品和热破坏它。

在另一种方法中，光镜—拉曼联用仪器配有步进电机驱动的定位台，以光栅扫描样品并收集拉曼光谱，这种被称为拉曼光谱的技术可以用来从每个光谱中提取相关的化学信息，并以几微米的横向分辨率绘制样品中化学成分的分布图。

由于使用这些仪器采集典型的拉曼光谱可能需要几秒钟的积分时间(或者甚至更长，取决于所需的信噪比和样品的散射效率)，一般认为这种技术非常慢，并且采集样品的拉曼图需要几个小时。如果使用每个频谱仅1秒的积分时间，则60×60像素拉曼图仅积分就需要60×60=3600s，1h。加上用步进电机定位样品所需的时间，以及CCD的读出时间和反向扫描的时间，该实验所需的总时间很容易就会增加一倍。

保持系统稳定，并在这一时间尺度上获得优于1微米的精度是一个挑战，60X60像素的地图只是一个很小的图像，如果是200×200 = 40000像素光谱图，在每个频谱的积分时间不显著降低的情况下，生成拉曼图几乎是不可能完成的任务，只有每个光谱的积分时间必须减少到100毫秒甚至更少才行。

因此，开发了多路设置来提高采集速度，类似于从单点、零维PMT到一维CCD的转换。

一种想法是照射一条完整的线，并将这条线投射到光谱仪的入射狭缝上并扫描整个样品。CCD相机的垂直轴可用于位置信息，水平轴用于能量分散。利用这种技术，人们可以同时获得沿着照明线的数百个光谱，这种技术被称为“线成像”。

另一种方法是将光通过(可调谐的)窄带滤光片发送到成像CCD上，从而将样品作为一个整体均匀照射，并在没有分光计的情况下获取所需的光谱信息。单次曝光收集整个样品的拉曼光，并且不再需要扫描。这种模式不可能在每个图像点收集完整的拉曼光谱，相反，光谱信息必须通过在不同的滤波器通带位置拍摄几幅图像来获得，这种技术被称为“全局成像”。

尽管这些技术将探测速度提高了几个数量级，但它们具有严重的缺点，在大多数情况下妨碍了它们的有用应用。一个主要的缺点是这两种技术都不是共焦的，因此要么有狭缝而不是圆形针孔，要么根本没有针孔。

“共焦”被定义为“具有相同的焦点”，其中用点光源照射样品，并通过探测器前面的针孔探测该点的图像。照明点光源和针孔都位于同一焦平面上。通过在样品上逐点和逐行扫描激光焦点，或者通过在激光点下扫描样品，可以获得样品的图像。由于信号是通过针孔探测的，因此只有来自焦平面的光才能到达探测器。在焦平面之上或之下发射的光在针孔平面中没有聚焦，因此对图像没有贡献。

3共焦

拉曼光谱的最大干扰因素是荧光。由于荧光是光与电子样品态的共振相互作用，荧光的效率可以很容易地比拉曼相互作用的效率高6个数量级。如果样品在用于拉曼的激发波长下显示荧光，在大多数情况下，荧光强度如此之高以至于不能探测到拉曼信号。

因此，通过使用不显示样品荧光的激发波长，或者减少探测体积，尽可能减少荧光背景是极其重要的。

不幸的是，不可能总能找到没有荧光的激发波长，因为与拉曼散射相比，荧光过程效率高。在这些情况下，共焦探测装置将荧光的收集限制在从焦平面发射的光子，这将急剧地减少荧光背景信号，从而在许多情况下可以获得拉曼图像。如果荧光是由杂质而不是样品本身引起的，共焦拉曼图像通常给出非常有用的结果，而非共焦技术仍然会从焦平面上方和下方的区域收集的过多的荧光。

由于共焦探测原理将探测到的光限制在焦平面上，所以它还可以进行3D和透明样品的光学截面分析（不将样品切成两半）。如果样品是支撑基底上的薄层，共焦设置允许样品信号与背底信号分离。比如，盖玻片(170μm厚)上厚度小于1μm的聚合物样品，产生的拉曼信号比玻璃基材本身小100倍以上，非共焦技术几乎无法进行分析。

非共焦技术或许有其独特的应用，但共焦技术在空间分辨率和背景抑制方面可提供最佳的结果。

4共焦拉曼显微镜的通量

因为拉曼信号非常弱，所以优化共焦拉曼显微镜的通量以在短时间内进行共焦拉曼成像是非常重要的。图1显示了由激发激光器、显微镜和带有CCD探测器的光谱仪组成的典型拉曼显微镜系统示意图。样品的扫描运动由压电扫描器执行，当配备位置传感器时，该扫描器非常快速且极其精确。

为了优化拉曼信号，系统的每个部分都必须针对最高的传输和效率进行优化。如果元件选择不当，灵敏度很容易下降一个数量级。如果需要单个光谱，通常所需的积分时间是1s还是10s并不重要，但如果一幅图像需要15分钟或2.5小时，则差别很大。

图1带有光纤耦合激光源和光谱仪的拉曼显微镜的典型

4.1激光的波长

拉曼散射强度正比于ν4，ν是激发激光辐射的频率。因此，400nm的激光比800nm的激光产生高16倍的拉曼信号。另一方面，许多样品在紫外或蓝色区域被激发时具有强荧光，而在红色或NIR区域被激发时具有低荧光。

激发波长越短，横向分辨率越高，因为分辨率由下式给出d=0.61λ/NA，d是两点之间最短的可分辨距离，λ是波长，NA是所用物镜的数值孔径。这个关系也表明数值孔径同样重要。在400到900 nm的范围内，高NA物镜容易获得。350 nm以下的UV波长，拉曼散射高，但可用物镜数量有限。此外，高能量光子会造成样品损坏，也成为一个问题。在长波长下，横向分辨率降低，拉曼效率大幅下降，但荧光不太可能出现。

适用于拉曼显微镜的激光器应该具有：高斯光束形状，可以聚焦到衍射受限的点；线性偏振，以允许观察偏振相关的样品特性；具有远低于1cm-1的窄线形，以避免加宽拉曼谱线；频率稳定(变化<0.01cm-1)，以允许高精度的应力测量；强度稳定(<1–2%的功率波动)，以实现精确和浓度的测量。

另外，拉曼信号与激发功率成正比，但可接受的激光功率取决于激光波长、样品特性(吸收、导热性等)和其他成像条件(激光焦点直径等)。功率可以从uW变化到几百mW。如果样品是透明的，对于300 nm的光斑尺寸，绿色激光可接受的功率约是10 mW。

4.2物镜

为了获得最高的收集效率和最佳的空间分辨率，应使用高数值孔径的物镜。好的物镜在500nm波长下有80–90%的透射率，但在900nm波长下只有40%甚至更少。其原因在于，对可见光中具有小于0.5%反射率的抗反射涂层在红外中的反射率会高得多。这一点特别重要，因为光线必须穿过物镜两次。

选择物镜时，还需要考虑样品的平坦度，因为高NA物镜具有良好的深度分辨率（适合高度平整的样品），这意味着，具有高低起伏形貌的样品有时会聚焦在样品表面上，而有时不会。这种情况下，使用低NA的物镜可能是有益的。

4.3显微镜的通量

显微镜的通量与物镜的通量一样重要。光必须通过显微镜两次，因此损耗是平方的，具有优化通量的光学组件损耗更低。用二向色或全息分束器将激光束耦合到显微镜中，该分束器对于激光激发波长的反射率应该尽可能高，而对于拉曼光的透射率也应该高。现在的涂层技术，可以获得具有反射性的二向色滤光器（透过率>95%），对于150rel.cm-1以上的斯托克斯位移拉曼光的透射率约98%。只有在探测到反斯托克斯拉曼光谱时，才需要全息滤光片。

为了有效地抑制瑞利线，应该使用一个边缘或槽口滤波器，它可以将激光线强度降低6个数量级，同时对斯托克斯偏移的拉曼线有一个>95%的通过率。

4.4显微镜和光谱仪之间的耦合

显微镜和光谱仪之间的光学耦合极其重要，必须将显微镜发出的光有效地耦合到光谱仪中。如果用平均反射率为85%的金属镜，经过4面镜子之后，信号就损失了50%。

此外，光必须耦合到分光计的入射狭缝中，并且其孔径必须转换成分光计的入射孔径。比分光计接收角更大的发散度将导致巨大的信号损失，更小的发散度将导致分辨率降低，因为光栅仅被部分照射。

如何达到有效的共焦？共焦针孔的尺寸须根据物镜像的点扩散函数直径来选择。例如，在633 nm激发波长下，NA = 0.9的X100物镜，会在像平面中产生43?m的衍射受限艾里斑。此时，50?m的共焦针孔直径是理想选择（最大深度分辨率和高收集效率）。

为了避免信号损伤，通常选择一根芯径为50微米的多模光纤。该光纤可作为：

1.一个针孔，因为只有核心部分可以引导和传输光。

2.一个效率极高的导光板（如果使用无涂层的入口和出口表面，唯一的损失是4%的入口和出口损失）。

3.作为光谱仪的入口狭缝和作为一个光圈匹配装置。光纤的出口光圈（NA=0.12）与光谱仪的光圈完全匹配。

目前，大多数市售光谱仪的通量（包括光栅）只有30-35%（@532 nm），尽管光栅的效率高达80%。这意味着超过50%的光在光谱仪镜面的涂层中损失了，其原因是大多数光谱仪没有针对拉曼信号的小频率范围进行优化（优化可以提高一倍）。

4.5光栅

光谱仪中的光栅通过将每个波长以略微不同的角度偏转，将信号分散到CCD探测器上。高数量的沟槽/毫米（线/毫米）会导致高分散性和高分辨率，但也将信号分布在大量的CCD像素上。对于典型的样品，用于共焦拉曼显微镜的最窄线的宽度（FWHM=半最大值全宽）不低于2-3cm-1。因此，分辨率约为1cm-1的光谱仪是折衷选择。

有多个光栅可以切换是非常有用的，这样就可以使用一个与探测器尺寸匹配的光栅，以确保探测器覆盖全部拉曼光谱（100至3600rel.cm-1），以及提供约1cm-1分辨率的高分辨率光栅。

为了优化效率，光栅通常是针对某一波长，这意味着沟槽是有角度的，这样光栅的效率在第一衍射阶数上可以达到80%。光栅效率设定了光谱仪的通量的上限。图中显示了一个600线/毫米的光栅效率，波长为500nm。

可以看出，光栅效率在某一波长处达到峰值，并在较短的波长处显示出强烈的下降。在较长的波长下，下降幅度较小，但如果该光栅在785nm的激发下使用，其效率会降低2-3倍。

图2典型的绝对反射效率，对于600线/毫米光栅的500nm的非偏振光的一阶反射

4.6 电荷耦合器件（CCD）探测器

CCD探测器是拉曼显微镜的关键部件，其对仪器的性能影响很大。CCD相机有各种各样的探测器尺寸，非冷却或带珀尔帖或液氮（LN）冷却，正面或背面照明，作为深耗损模型或带紫外线涂层，这只是数百种变化中的几个。

CCD探测器由一个光敏硅-光电二极管阵列组成，每个都与一个电容器相连。在光电二极管中，每一个探测到的光子都会产生一个电子-空穴对，这些空穴对被内部电场分离，电子被储存在电容器中。分光探测器的典型探测器尺寸是1024X127像素，像素尺寸为26微米X26微米。

探测器的第一个重要特征是其量子效率（QE）。QE是指探测到的光子占总入射光子的百分比。由于CCD的感光区被电气互连线部分阻挡，典型的CCD（正面照明）探测器的QE在500nm时约为45%。为了提高探测效率，背照式CCD设备被开发出来，这意味着它们被蚀刻到约17微米的厚度，光线从背面进入。通过这种技术和适当的防反射（AR）涂层，可达到90%以上的QE（@500nm）。

典型的正面和背面发光的探测器的QE曲线的比较见图3。

图3背照式（黑色）、背照式深耗损（红色）和前照式（蓝色）CCD探测器的典型QE曲线与波长的关系

QE决定了拉曼实验中探测到的信号。但信号中的噪声或探测器本身产生的噪声同样重要。因为信噪比（S/N）决定了测量的质量。理想情况下，噪声应该由信号本身的射出噪声所主导。其他每一个噪声源应尽可能小。

热噪声是由探测器本身的热激发载流子产生的，可以通过冷却探测器（珀尔帖冷却器）来大大减少。在60℃时，对于背照式CCD来说，由热激发电子引起的典型背景信号为0.01电子/像素/秒。因此，如果探测器保持在60℃或更低的温度，热噪声（即热产生的电子数的平方根）可以在几分钟的积分时间内被消除掉。热噪声通常不是一个限制性因素。

更重要的是探测器本身的读出放大器的读出噪声。读出噪声以电子表示，取决于读出放大器的质量以及读出速度。对于较长的积分时间(>50毫秒），一个慢速读出放大器就足够了。一个高端的33kHz读出放大器产生的噪声小于4个电子。在100kHz的读出速度下，最好的相机的读出噪声在10个电子左右，而在2.5MHz的读出速度下，它可以很容易地达到35个电子。

使用一个1024x127像素的探测器和一个33kHz的读出放大器，最小的积分时间将是大约32毫秒（31个光谱/秒）。一个由256条线组成的图像，每条线有256个光谱（65635个光谱），用这个积分时间获得的图像将需要大约2100秒=35分钟的采集时间。

如果使用100kHz的读出放大器，最小积分时间从32秒减少到大约12毫秒（83个光谱/秒），可以在13分钟内获得图像，但此时的读出噪声等于100电子/像素。

如使用2.5MHz的读出放大器，积分时间可减少到1毫秒（1000个光谱/秒），采集时间可以低至1分钟，但可用的信号减少了32倍，读出噪声急剧增加。

在非常短的积分时间（快速扫描），读出噪声开始支配所有其他的噪声源。

理想情况下，人们希望有一个具有100% QE的探测器，没有热噪声，没有读出噪声或任何其他噪声源。这种理想的探测器将总是被射出噪声限制，这是在物理学允许的范围内最好的。如果使用长积分时间，具有良好冷却效果的背照式CCD就非常接近于这种理想的探测器。

最近CCD技术的发展导致了一种更接近理想探测器的探测器（至少在一定的波长范围内是如此），这种探测器被称为EMCCD（(electron multiplying CCD，电子倍增CCD）。

4.7电子倍增CCD——EMCCD

EMCCD是一个普通的CCD，带有一个额外的读出寄存器，其驱动的时钟电压比普通的CCD读出寄存器高得多。由于这个高的时钟电压，通过冲击电离实现了电子倍增，信号的总放大倍数可到1000倍。

当载流子在读出寄存器中从一个像素转移到另一个像素时，产生多余载流子的概率极低（最大1.0043），但由于这个过程要重复1600次，总放大倍数可以高达1.00431600=1000。这样，总是可以把信号放大到读出噪声以上，这样信噪比总是受到信号的泊松噪声的限制，即使使用非常快的读出放大器。这时的信号被称为射出噪声限制。

举个例子，一个1600 x200像素的EMCCD，使用2.5MHz的读出放大器，可以在1.3ms内读出（760光谱/s），而不会像普通CCD那样受到读出噪声的限制。

如果将读出限制在CCD芯片的几条线上，甚至有可能超过1300个光谱/秒。

如果信号不受读出噪声的支配（大信号，长积分时间），就可以使用"正常"的读出寄存器，EMCCD的行为就像最先进的背照式CCD。

尽管EMCCD相机非常敏感，能够检测单光子，但它不能被用作单光子检测装置，因为它缺乏一个鉴别器。EMCCD与标准CCD相比，可提高信噪比，特别是对于非常低的信号水平和快速读出。图4显示了EMCCD与传统CCD相比，在4、10和35电子读出噪声（33、100kHz和2.5MHz读出速度）下计算出的信噪比与信号（每像素光子）的关系。

图4背照式EMCCD探测器的信噪比与传统背照式CCD相机比，不同的读出噪声水平（4、10和35电子），慢速（33kHz）、中速（100kHz）和快速（2.5MHz）。箭头表示，在不同的读出噪声水平下，EMCCD的信噪比超过传统探测器的光子数量（18、111、1362）。

图5与传统的背照式CCD相机相比，背照式EMCCD探测器在不同的读出噪声水平（4、10和35电子）下信噪比的提高，这是典型的慢速（33kHz）、中速（100kHz）和快速（2.5MHz）读出速度与每像素光子的关系。

4.8EMCCD的实测案例

样品是一个旋涂在玻璃基底上的超薄聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）薄膜。该层被划伤，并在样品的一些区域去除了PMMA。样品层的高度由原子力显微镜AFM确定为7.1nm。此外，在表面发现了一个针状的污染，厚度为4.2nm。这个污染层的来源和材料组成最初并不清楚，但可以通过共焦拉曼测量来确定。

图6是通过在50x50 ?m的扫描范围内获取200 x200个拉曼光谱，并对PMMA的CH拉伸带的强度在3000 rel. cm?1左右进行积分得到。激发功率为20 mW @532 nm，使用100×，NA为0.9的物镜。

图6玻璃上7.1nm PMMA层的共焦拉曼图像在2950 rel. cm?1左右的CH拉伸带处获得。a背照射式CCD。b, c EMCCD。比例尺10 ?m。d样品示意图

图7拉曼光谱（左图）。玻璃（蓝色）上7.1 nm PMMA层（红色）和4.2 nm污染层（绿色）的共焦拉曼图。200x200张光谱，每张光谱7毫秒的积分时间。总采集时间：5.4分钟。（右图）

从图7可以看出，玻璃基底有一个小的拉曼带，其信号是PMMA信号的一半，而在完全相同的区域有3倍的烷烃信号。很明显，拉曼系统的共焦性对于研究薄层是至关重要的。

即使有最好的共焦设置，信息深度也至少是500nm，这意味着500nm的玻璃对拉曼信号有贡献。由于拉曼信号与材料的数量成正比，一个标准的（非焦距）设置会收集到超过300倍的玻璃信号（170微米的玻璃盖板厚度），使得对薄涂层的探测成为不可能，即使有更长的积分时间。

5结论

共焦拉曼成像是一种强大的技术，在各种科学领域都有应用。共焦性可以抑制不需要的荧光背景以及来自基底的背景，还可以以一定深度分辨率进行深度扫描。由于图像中存在大量的光谱，每个光谱的积分时间必须保持尽可能短。因此，系统的通量非常关键，高通量光谱有助于获得高质量光谱。

使用EMCCD，即使在极低的信号水平下，光谱也可以保持近乎射出噪声的限制。相比最好的CCD，EMCCD可以使信噪比提高10倍以上，而对于较大的信号，可以关闭EMCCD，并保留标准背照式CCD的所有特性。

玻璃基底上7.1nm的PMMA以及4.2nm烃层的分布可以很容易被EMCCD探测和识别，每个光谱的积分时间仅为7毫秒。这使得200X200 (=40,000)个光谱的共焦拉曼图像的总体采集时间减少到仅为5.4分钟。在532nm激发下，使用NA=1.4的油浸物镜，该共焦图像的衍射限制空间分辨率为230nm。