FLIM系统是如何进行工作的？

荧光寿命显微成像(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)是一种用于研究和测量生物分子的荧光寿命的技术，因其可以用于无标记成像，具有快速响应时间，可通过高分辨率成像技术（如共聚焦显微镜或双光子显微镜）结合使用等特点，近年来已经广泛应用于生物学、医学研究和生命科学等相关领域。那么，FLIM是如何实现如此强大的功能呢？

FLIM的首要任务就在于测量荧光寿命(fluorescence lifetime, FL)，待测物体被一束激光激发后，该物体吸收能量后，从基态跃迁到某一激发态上，再以辐射跃迁的形式发出荧光并回到基态。将激发光关闭后，分子的荧光强度也将随时间逐渐下降。

假定一个无限窄的脉冲光（δ函数）激发n0个荧光分子到其激发态，处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为Γ和Knr，则激发态衰减速率可表示为：

其中n(t)表示时间ｔ时激发态分子的数目，由此可得到激发态物种的单指数衰减方程：

上式中衰减总速率的倒数τ＝(Γ＋Knr)-1即为荧光寿命。荧光强度正比于衰减的激发态分子数，因此可将上式改写为:

该式中，I0即为分子受激发时的zui大光强。我们将该荧光强度下降至激发时的荧光zui大强度I0的1/e（约37％）所需要的时间，称为荧光寿命。

图1 荧光寿命曲线示意图

对于测量荧光寿命的方式可大致分为以下两种，频域法与时域法。而时域法还可进一步分为门控法、条纹相机法与tcspc法（Time-Correlated Single photon counting, 时间相关单光子计数）。目前，应用zui为广泛的是TCSPC法，其基本原理是在一个极短的时间窗口内精确测量单个光子的到达时间。当激光或其他光源激发样品时，样品会发射荧光光子。这些光子传播到检测器，其中每个光子的到达时间都被记录下来。记录到达时间的数据可以被用来创建荧光寿命的时间衰减曲线，该曲线描述了荧光光子的时间分布。通过分析这些时间分布，可以获得关于样品的信息，如荧光寿命、发光光谱和荧光量子产率。其基本原理是测量光子到达探测器的时间。当一个光子被探测到时，会触发一个计数器，记录光子到达的时间。通过多次测量并记录光子到达的时间，可以生成光子到达时间的分布曲线，如图2所示，从而获得有关样品的信息。

图2TCSPC原理示意图

TCSPC系统具有非常高的时间分辨率，通常在皮秒（ps）级别。这使得它能够精确测量光子到达时间，即使在非常短的时间尺内也能实现准确的测量，且可以处理极低光子计数的数据。基于统计分析的TCSPC法避免了荧光强度的直接测量，因而信噪比较高，探测效率近乎理想。但由于通常需要多次重复扫描来为每个像素采集足够多的光子用于拟合荧光寿命，成像时间通常会较长。因此，如何提高成像速度与测量精度成为了人们关注的重点。近些年来，随着超快激光技术、高速高灵敏探测技术以及图像处理技术等相关技术发展，为开发廉价、高性能、多功能的荧光寿命成像系统创造了条件。

图3FLIM系统示意图

上海昊量光电zui新推出了意大利FLIM LABS公司的荧光寿命成像FLIM入门套件系统，专门为追求单光子FLIM成像和荧光寿命光谱应用而设计，能为您带来高性能、高性价比的FLIM解决方案。该套件包括荧光寿命成像FLIM数据采集卡tdc、光纤耦合皮秒脉冲激光器模块、SPAD单光子探测器与荧光寿命成像FLIM软件，并在您需要时提供恒比鉴相器模块。

图4 FLIM LABS的荧光寿命成像FLIM入门套件

FLIM数据采集卡TDC：

我们的紧凑型USB 供电数据采集卡专为荧光寿命成像和光谱测量而设计。其基于FPGA的可定制技术，尺寸101x139x28mm，重量轻（仅120克），总计26个I/O通道可分辨荧光寿命50ps，死区时间1.5 ns，计时精度（σ/√2）300ps，24 或 48 ps 时间 bin 分辨率，并能通过USB3.0与PC软件直接连接，无需额外供电。

光纤耦合皮秒脉冲激光器模块：

我们的激光器模块可用波长有405、445、488、520、635 和 850 nm，谱宽±10nm，独立模块，无需连接电脑。脉冲持续时间低至50ps (FWHM)，单模光纤耦合（FC/PC），150mW脉冲峰值，功率80MHz 时平均 CW 功率为 1.5mW，提供外部和内部数字同步触发。

SPAD单光子探测器：

我们的USB 供电光纤耦合单光子 SPAD 探测器专为时间分辨荧光寿命成像和光谱测量而设计。尺寸小（100x60x30mm）且重量轻（235g），可通过USB 供电，光谱响应范围从370nm 到 900nm，7 cps 暗计数，抖动小于200ps。

荧光寿命成像FLIM软件：

我们的FLIM Studio软件旨在简化荧光寿命光谱和成像实验的数据采集、重建和分析。该环境提供了用户友好的界面和任何用户都可以使用的直观工具。可以做到实时成像和荧光衰减直方图数据重建，实时FLIM 相量图分析，并人工智能驱动的相量图分析技术，提供用于数据采集和重建的软件API（Rust、C、C++、C#、Python、node.js、.NET），支持MATLAB、Python、HDF5、.SVG FLIM 相量和成像数据导出。

恒比鉴相器CFD：

我们的恒定分数鉴别器（CFD）结构紧凑，性能卓越。恒比鉴相器CFD允许用户将模拟信号（例如，来自PMT的信号、脉冲激光源的同步信号等）转换为数字信号。恒比鉴相器CFD模块非常易于使用，可以与不同的显微镜或光谱设置相结合。单通道双输出模块，区分正负输入信号，支持上升时间<500ps，抖动<15ps，zui大重复频率为140MHz，zui小输入可检测信号为+/- 100mV，zui大输出信号：4V@50Ohm 。

审核编辑 黄宇