构建一种基于噬菌体的新型纳米生物传感器

病原微生物的早期和快速检测对于解决严重的公共卫生问题至关重要。据麦姆斯咨询报道，近日，埃及泽维尔科技城（Zewail City of Science and Technology）的科技大学（UST）及微生物学和噬菌体治疗中心（Center for Microbiology and Phage Therapy）的研究人员构建了一种基于噬菌体的新型纳米生物传感器，该传感器对电化学阻抗测量法进行了大量优化，并将其应用于食品样品中大肠杆菌O157:H7的定量检测。研究人员利用循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）确定了使用由金纳米颗粒（AuNP）、多壁碳纳米管（MWCNT）和氧化钨（WO3）纳米结构组成的纳米复合材料对一次性丝网印刷电极电化学性能的影响。纳米材料的使用使其对靶向细菌宿主细胞具有很高的捕获灵敏度，其检测限（LOD）为3.0菌落形成单位（CFU）/ml。

此外，研究人员利用共价固定化活性噬菌体对几种非靶向细菌菌株的选择性进行了测试，获得了较高的特异性。在食品样品中以高特异性成功地检测到目标食源性病原体，该传感器提供了90%~108%的优良回收率。因此，新开发的噬菌体生物传感器被作为一次性无标记阻抗生物传感器，用于快速和实时监测食品质量。

阻抗测量是一种无标记、高度敏感且不受复杂样品基质中混浊或有色组分影响的技术，其在此实现了构建用于快速细菌识别的强大噬菌体纳米传感器。T4型噬菌体（ZCEC5）因其对大肠杆菌O157:H7的全细胞检测的高灵敏度和选择性，被选为活性生物识别元件。

为了将活性噬菌体有效地共价固定在用纳米材料修饰的传感器表面上，研究人员将4-氨基硫酚（4-ATP）自组装到纳米结构表面上，进而与戊二醛链活化以形成定向良好的自组装单分子层（SAM），如图1所示。同时，研究人员对其进行了电化学表征（图2A和2B），其中循环伏安法和电化学阻抗谱测量表明，纳米复合材料的掺入致使协同电化学增强（标准氧化还原探针的氧化还原反应速率增加），这是由于氧化钨和碳纳米管具有较高的导电性、电催化活性及其表面积的扩大。同时，电化学阻抗谱数据证实了纳米复合材料对于降低阻抗信号的重要性，这是由于电子从溶液界面向电极表面的转移速度加快了。

图1 用于大肠杆菌快速阻抗检测的噬菌体生物传感方法的后续制作过程

图2 （A）作为标准氧化还原探针的铁氰化物（FCN，5 mMol）氧化还原反应电极表面的循环伏安响应；（B）作为标准氧化还原探针的铁氰化物（FCN，5mMol）氧化还原反应电极表面的阻抗响应；（C）活性噬菌体固定前后电极表面的阻抗响应；（D）基于噬菌体的纳米生物传感器制备步骤的FTIR光谱。

研究人员在四种不同的条件下，测试了将固定化噬菌体与其靶向宿主（大肠杆菌O157:H7）之间的选择性结合相互作用转化为可测量和可量化的阻抗信号。噬菌体传感器对细菌悬浮液的捕获效率是在没有氧化还原介质的磷酸盐缓冲液（PBS，作为唯一电解质）中测量的，或使用包括铁氰化物或2,6-二氯靛酚钠（DCIP）的单一介质测量。最终，研究人员应用了两种介质（DCIP/FCN）的组合。结果表明，当使用双介导系统（DCIP/FCN）时，获得了代表最高灵敏度的最高阻抗信号。如图3A所示，仅使用铁氰化物，以及在没有任何氧化还原介质的磷酸盐缓冲液中进行电化学阻抗谱测量，奈奎斯特图均未显示出任何显著变化。因此，研究人员才选择了双介导系统进行进一步优化。

图3 （A）电化学阻抗谱奈奎斯特图显示噬菌体传感器对所选病原体菌株的捕获效率；（B）传感时间对噬菌体生物传感器产生电化学阻抗谱信号的影响。

针对噬菌体生物传感器的选择性和效率，研究人员在多细菌浓度范围内（从10?~10? CFU/ml）进行了评估，同时记录了每种浓度的电化学阻抗谱，如图4A奈奎斯特图所示。结果表明，细菌浓度的增加与阻抗信号的增加有强相关性，如图4B所示。为了提取图中的Rct值，研究人员对特定的等效电路进行了建模（图4C）。当细胞浓度达到10? CFU/ml时，该传感器表面发生的连续结合事件导致的Rct增加值达到最大。在该浓度下，该传感器达到了一种表面饱和水平，这是噬菌体传感器捕获目标宿主细胞的最大容量。该研究的检测限为3.0 CFU/ml，达到了极高的灵敏度。

图4 （A）由发生在噬菌体生物传感器表面的成功结合事件产生的阻抗校准曲线的奈奎斯特图；（B）Rct值变化与细菌计数增加的关系；（C）用于提取电化学阻抗谱参数的Randles等效电路。

由于生物识别元件的选择对于提供最大的选择性和特异性始终是很必要的，因此针对新开发的基于噬菌体的生物传感器的生物传感性能，在许多其它细菌菌株中也进行了测试，如图5所示。结果显示，当测试外来细菌菌株时，该传感器获得了高选择性，而响应并不显著。因此，该噬菌体作为生物识别元件为靶向生物体提供了快速、选择性和定量的阻抗测量检测。

图5 基于噬菌体的生物传感器对靶向和非靶向菌株的阻抗响应

为了确保基于噬菌体的生物传感器可用于样品分析，研究人员对各种食品样品（包括牛肉、白奶酪、番茄汁、自来水和午餐牛肉样品等）的合成细菌污染（将大肠杆菌O157:H7以10? CFU/ml的浓度加入食品样品）进行了测试。同时，未感染（未污染）的样本也作为阴性对照纳入该测试。针对每个样品，研究人员使用单独的传感器芯片，并计算ΔRct的变化。进行该试验的同时，研究人员进行了CFU平板计数来验证。获得了90%~100%的回收率。

综上所述，随着高传染性菌株的不断出现和细菌感染的增加，电化学纳米生物传感器的开发通常仅用于一次性测试，以提供快速的现场检测，免除传感器的清洁程序同时避免交叉污染。本文中，研究人员使用由金、氧化钨和多壁碳纳米管（Au/WO3/MWCNT）组成的纳米复合材料对一次性丝网印刷电极进行功能化，以提供高电催化和电化学读数。

作为一种生物识别元件，裂解噬菌体（大肠杆菌T4型病毒）被共价固定在纳米传感器的表面，该传感器与4-氨基硫酚和戊二醛的自组装单分子层交联。研究人员采用伏安法和阻抗法对样品进行电化学表征，用阻抗法对样品进行了分析优化和实际样品分析。基于噬菌体的生物传感器提供的高灵敏度和选择性，成功地对食品样品进行了分析。因此，该生物传感器非常有前途，并为使用一次性和现场设备进行病原体诊断开辟了一条新途径。

审核编辑：刘清